Publication detail

MICROCHIP ISOLATION COMBINED WITH MS-IDENTIFICATION OF PHOSPHOPROTEINS FROM FRANCISELLA TULARENSIS

Year: 2012

Type of publication: článek ve sborníku

Name of source: CECE 2012: 9th International Interdisciplinary Meeting on Bioanalysis

Publisher name: Ústav analytické chemie AV ČR, v. v. i.

Place: Brno

Page from-to: 69-73

Titles:

Language	Name	Abstract	Keywords
cze	Izolace fosfoproteinů bakterie Francisella tularensis pomocí mikročipu v kombinaci s MS identifikací	Posttranslační modifikace proteinů, jako je fosforylace, hrají klíčovou roli v mnoha biologických procesech. Fosfoproteiny v nízkém zastoupení typicky vyžadují prekoncentraci a izolaci před analýzou pomocí hmotnostní spektrometrie (MS). Pro tyto potřeby jsme vyvinuli nový metodický přístup založený na obohacení fosfopeptidů pomocí magnetických TiO2 nanočástic v mikrofluidním čipu. Obohacené fosfopeptidy byly následně separovány pomocí mikrokolonové reverzně-fázové kapalinové chromatografie za použití gradientové eluce s ,,off-line" aplikací na MALDI destičku. Pro potvrzení fosforylace byla po MS a MS/MS analýze provedena defosforylace na MALDI desce pomocí alkalické fosfatázy. Získaná spektra byla porovnána před a po defosforylaci, což zvýšilo pravděpodobnost správné identifikace. Tento postup byla nejdříve aplikován na alfa-kasein naštěpený trypsinem a poté na lyzát bakterie Francisella tularensis subsp. holarctica kmen FSC200 naštěpený trypsinem. Nakonec byly fosfoproteiny identifikovány použitím databázového vyhledávání s manuální evaluací.	Francisella tularensis; Izolace fosfoproteinů
eng	MICROCHIP ISOLATION COMBINED WITH MS-IDENTIFICATION OF PHOSPHOPROTEINS FROM FRANCISELLA TULARENSIS	Posttranslational modifications of proteins, such as phosphorylation, play a key role in many biological processes. Low abundances phosphoproteins digested into peptides typically require isolation and preconcentration before MS analysis. For these purposes we developed new methodical approach based on phosphopeptides enrichment by magnetic TiO2 particles in microfluidic chip. Enriched phosphopeptides were subsequently fractionated by microcolumn RP-LC using gradient elution and offline application to MALDI plate. For confirmation of phosphorylation MS and MS/MS analysis was followed by on-plate dephosphorylation by alkaline phosphatase. The obtained spectra were compared before and after dephosphorylation, which enhanced the probability of a correct identification. This procedure was applied firstly to tryptic digest of alpha-casein and then to digest of Francisella tularensis subsp. holarctica strain FSC200 (FTH FSC200) lysate. Finally bacterial phosphoproteins were identified using database searching and manual evaluation.	microfluidics, phosphoproteins, Francisella tularensis

Search

Login for students

Login for employees

Publication detail

Departments

Other Parts

Map

Services

Popular Links