University of PardubiceFaculty of Chemical Technology

University

Employees
|
Students
Česky

Publication detail

Kinase-loaded magnetic beads for sequential in vitro phosphorylation of peptides and proteins

Authors: Hromádková Lenka | Kupčík Rudolf | Vajrychová Marie | Přikryl Petr | Charvátová Andrea | Jankovičová Barbora | Řípová Daniela | Bílková Zuzana | Slováková Marcela

Year: 2018

Type of publication: článek v odborném periodiku

Name of source: Analyst

Page from-to: 466-474

Titles:

Language	Name	Abstract	Keywords
cze	Magnetické částice s vázanými kinázami pro sekvenční in vitro fosforylace peptidů a proteinů	Posttranslační modifikace včetně fosforylace významně ovlivňují fyziologickou funkci bílkovin, zvláště těch přirozeně nesbalených a zapojených do mnoha neurodegenerativních onemocnění. Nicméně strukturální a funkční studie takových proteinů vyžadují plně definovanou fosforylaci, včetně těch, které nejsou fyziologické. Proto byly kinázy ERK2 a GSK-3p imobilizovány na různé superparamagnetické částice s karboxylovými, aldehydovými, Ni2 + nebo Co3 + funkční skupiny, s cílem účinně fosforylovat peptidy a proteiny in vitro. Úplná fosforylace specifických syntetických peptidů potvrdila úspěšnou vazbu kináz. Enzymy kovalentně imobilizované na karboxylovaných částicích SeraMag zůstaly aktivní při opakovaném použití, přičemž po 10 použitích byla reziduální aktivita 99,5 ± 0,34% pro GSK-3β a 36,2 ± 2,01% pro ERK2. Částice byly také použity k postupné fosforylaci rekombinantního tau, který je v podmínkách in vivo biomarkerem Alzheimerovy choroby. Systém sestávající ze dvou plně aktivních kináz imobilizovaných na magnetických částicích je tak představen poprvé. Ve srovnání s rozpustnými enzymy jsou fosforylace s enzymy vázanými na částicích snadněji proveditelné, je možné je opakovaně použít a tedy s nízkými náklady. Důležité je, že tyto částice jsou také snadno odstranitelné z fosforylačních reakcí, a minimalizuje se tak kontaminace fosforylovaných produktů nebo se tak umožní výměna s jinými kinázami.	Magnetické částice; imobilizovaná kináza; sekvenční; in vitro; fosforylace; peptidů; proteinů
eng	Kinase-loaded magnetic beads for sequential in vitro phosphorylation of peptides and proteins	Post-translational modifications, including phosphorylation, greatly impact the physiological function of proteins, especially those that are natively unfolded and implicated in many neurodegenerative diseases. However, structural and functional studies of such proteins require fully defined phosphorylation, including those that are not physiological. Thus, the kinases ERK2 and GSK-3β were immobilized to various superparamagnetic beads with carboxylic, aldehyde, Ni2+, or Co3+ functional groups, with a view to efficiently phosphorylate peptides and proteins in vitro. Full phosphorylation of specific synthetic peptides confirmed that beads were successfully loaded with kinases. Remarkably, enzymes covalently immobilized on carboxylated SeraMag beads remained active upon reuse, with residual activity after 10 uses 99.5 ± 0.34% for GSK-3β and 36.2 ± 2.01% for ERK2. The beads were also used to sequentially phosphorylate recombinant tau, which in vivo is a biomarker of Alzheimer´s disease. Thus, a system consisting of two fully active kinases immobilized to magnetic beads is demonstrated for the first time. In comparison to soluble enzymes, the beads are easier to handle, reusable, and thus low-cost. Importantly, these beads are also convenient to remove from reactions to minimize contamination of phosphorylated products or to exchange with other kinases.	Kinase; magnetic; beads; in vitro; phosphorylation; peptides; proteins