University of PardubiceFaculty of Chemical Technology

University

Employees
|
Students
Česky

Publication detail

Izolace exozomů metodou imunoafinitní chromatografie: vliv elučních činidel na výtěžnost a čistotu

Authors: Ryšlavá Kateřina | Morávek Ondřej | Bílková Zuzana

Year: 2025

Type of publication: ostatní - přednáška nebo poster

Page from-to: nestránkováno

Titles:

Language	Name	Abstract	Keywords
cze	Izolace exozomů metodou imunoafinitní chromatografie: vliv elučních činidel na výtěžnost a čistotu	Exozomy jsou extracelulární vezikuly (30–200 nm) s významným diagnostickým a terapeutickým potenciálem. Podílejí se na mezibuněčné komunikaci, transportu biomolekul, regulaci imunity a tumorigenezi. K jejich šetrné izolaci se využívá imunoafinitní chromatografie s magnetickými částicemi [1], které nesou kovalentně navázané protilátky, nejčastěji proti tetraspaninům CD63, CD81 a CD9 [2]. Vazba exozomů na částice je specifická a reverzibilní, což umožňuje jejich selektivní zachycení a následnou eluci. Pomocí magnetu lze exozomy oddělit od ostatních složek biologického materiálu. Klíčovým krokem je správná eluce, která zajistí jejich vysokou výtěžnost a neporušenost pro další analýzy. Prvním úkolem bylo připravit afinitní nosič na bázi magnetických mikročástic ProMag s kovalentně navázanými protilátkami anti-CD63 IgG. Izolace exozomů probíhala za použití PBS pufru (pH 7,4), který zajišťoval optimální podmínky pro interakci mezi exozomy a navázanými protilátkami. Po inkubaci a promytí nosiče následovala eluce, jejímž cílem bylo získat exozomy v co nejvyšší čistotě a výtěžnosti bez jejich poškození, aby bylo možné analyzovat jejich složení. V první fázi experimentu byla porovnána tři eluční činidla: 1,5% SDC v 50 mM NH₄HCO₃ (pH 8,0), glycinový pufr (pH 3,0) a 1% kyselina mravenčí. Eluční frakce byly hodnoceny pomocí BCA a Dot-Blot metody. Nejvyšší koncentrace proteinu i intenzita signálu v Dot-Blotu (kvantifikace pomocí ImageJ) byly zaznamenány při použití 1,5% SDC. Na základě těchto výsledků byla dále testována eluce 1,5% SDC v různém prostředí: PBS, NH₄HCO₃ (pH 8,0), NH₄OH (pH 11,0) a destilovaná voda. Dále byla provedena srovnávací eluce v kyselém (glycin, pH 3,0) a zásaditém (NH₄OH, pH 11,0) prostředí. Nejlepší výtěžnost poskytla eluce pomocí NH₄OH (pH 11,0). Tato metoda se ukázala jako účinná a vhodná pro izolaci exozomů z biologického materiálu v kvalitě umožňující následné detailní analýzy (RNA, proteiny, lipidy). LITERATURA [1] Liangsupree	Exozomy; extracelulární vezikuly; izolace; magnetické částice; imunoafinitní chromatografie