Univerzita PardubiceFakulta chemicko- technologická

Univerzita Pardubice

Zaměstnanci
|
Studenti
English

Publikace detail

Možnosti separace a purifikace glutathionreduktasy

Autoři: Nýdlová Erika | Jankovičová Barbora | Roušar Tomáš

Rok: 2012

Druh publikace: ostatní - přednáška nebo poster

Strana od-do: nestránkováno

Tituly:

Jazyk	Název	Abstrakt	Klíčová slova
cze	Možnosti separace a purifikace glutathionreduktasy	Glutathionreduktasa je velmi důležitý antioxidační enzym, který se podílí na metabolismu glutathionu. Glutathion je nejvýznamnější intracelulární nebílkovinný antioxidant. Hlavní funkcí glutathionreduktasy je NADPH-dependentní redukce oxidované formy glutathionu (GSSG) na formu redukovanou (GSH). Cílem naší práce byla optimalizace purifikace glutathionreduktasy pomocí bioafinitní chromatografie s využitím různých elučních pufrů, které zabrání možnosti interference s dalším enzymem, glukóza-6-fosfátdehydrogenasou. Metoda bioafinitní chromatografie je vysoce selektivní a umožňuje separaci bílkovin i ve velice složité matrici, např. z lyzátů buněk či krve. My jsme jako zdroj biologického materiálu pro purifikaci použili lidské erytrocyty. Vlastní purifikace probíhala s využitím stacionární fáze 2´,5´-ADP-sefarózy, což je analog NADP, který je schopný stericky vázat většinu NADP-dependentních enzymů. Vzorek byl inkubován 90 minut v koloně naplněné nosičem. Po inkubaci byla kolona promývána ekvilibračním pufrem (100 mM draselnofosfátový pufr s EDTA; pH 7,5) kvůli vymytí ostatních bílkovin. Poté následovalo testování řady pufrů vhodných k eluci glutathionreduktasy - 400 mM draselnofosfátový pufr (pH 7,5); 100 mM draselnofosfátový pufr s NADPH (pH 7,5) a 100 mM draselnofosfátový pufr s GSH a NADPH (pH 7,5). V elučních frakcích jsme následně testovali aktivitu glutathionreduktasy s využitím spektrofotometrické metody, která je založena na měření poklesu absorbance způsobené oxidací NADPH na NADP+ při 340 nm (Tecan Infinite M200). Při tomto stanovení jsme používali dva substráty - GSSG (8 mM) a NADPH (0,8 mM). Pro stanovení specifické aktivity GR jsme také v jednotlivých elučních frakcích stanovili koncentraci proteinů metodou dle Bradforda. Zjistili jsme, že k eluci glutathionreduktasy došlo v přítomnosti 100 mM draselnofosfátového pufru s NADPH. Naopak k eluci glukosa-6-fosfátdehydrogenasy došlo pouze v přítomnosti 400 mM draselnofosfátového pufru.	glutathionreduktasa; glutathion