Publikace detail

Fractionation of Enriched Phosphopeptides Using pH/Acetonitrile-Gradient-Reversed-Phase Microcolumn Separation in Combination with LC-MS/MS Analysis

Autoři: Ondrej Martin | Řehulka Pavel | Řehulková Helena | Kupčík Rudolf | Tichý Aleš

Rok: 2020

Druh publikace: článek v odborném periodiku

Název zdroje: International Journal of Molecular Sciences

Název nakladatele: MDPI

Místo vydání: BASEL

Strana od-do: 3971

Tituly:

Jazyk	Název	Abstrakt	Klíčová slova
cze	Frakcionace obohacených fosfopeptidů s využittím separace na mikrokoloně pomocí pH/acetonitril-reverzně fázového gradientu v kombinaci s LC-MS/MS analýzou	Hmotnostní spektrometrie (MS) je výkonná a citlivá metoda, která je často využívána k identifikaci fosfoproteinů. Ve fosfoproteomice však byla zjištěna potřeba kompenzovat jejich malou abundanci, nedostatečnou ionizaci a potlačující efekt nefosforylovaných peptidů. To může bránit následné analýze pomocí kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie/hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS), což vede k neúplné charakterizaci fosfoproteomu, i když se používají přístroje s vysokým rozlišením. Abychom překonali tyto nevýhody, je zde předkládána efektivní chromatografická technika s mikrogradientem, která poskytuje specifické frakce obohacených fosfopeptidů přímo kompatibilních s LC-MS/MS analýzou. Účelem naší studie bylo zvýšit počet identifikovaných fosfopeptidů, a tím i pokrytí fosfoproteomu v analyzovaném vzorku pomocí reprodukovatelné a přímé metody frakcionace. Tento protokol zahrnuje krok obohacení fosfopeptidů, po kterém následuje optimalizovaná mikrogradientní frakcionace obohacených fosfopeptidů a konečná LC-MS/MS analýza získaných frakcí. Jednoduchý frakcionační systém se skládá z plynotěsné mikrostříkačky sloužící k tlačení optimalizovaného gradientu mobilní fáze do mikrokolony s reverzní fází. Naše data ukazují, že kombinace obohacení fosfopeptidů s mikrogradientní separací je slibnou technikou pro hloubkovou fosfoproteomickou analýzu i díky nenáročným požadavkům na vstupní materiál a navíc poskytuje více než trojnásobně lepší identifikaci proteinů.	fosfopeptidy; frakcionace; acetonitril; gradient; obohacení; hmotnostní spektrometrie; oxid titaničitý
eng	Fractionation of Enriched Phosphopeptides Using pH/Acetonitrile-Gradient-Reversed-Phase Microcolumn Separation in Combination with LC-MS/MS Analysis	Mass spectrometry (MS) is a powerful and sensitive method often used for the identification of phosphoproteins. However, in phosphoproteomics, there is an identified need to compensate for the low abundance, insufficient ionization, and suppression effects of non-phosphorylated peptides. These may hamper the subsequent liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis, resulting in incomplete phosphoproteome characterization, even when using high-resolution instruments. To overcome these drawbacks, we present here an effective microgradient chromatographic technique that yields specific fractions of enriched phosphopeptides compatible with LC-MS/MS analysis. The purpose of our study was to increase the number of identified phosphopeptides, and thus, the coverage of the sample phosphoproteome using the reproducible and straightforward fractionation method. This protocol includes a phosphopeptide enrichment step followed by the optimized microgradient fractionation of enriched phosphopeptides and final LC-MS/MS analysis of the obtained fractions. The simple fractionation system consists of a gas-tight microsyringe delivering the optimized gradient mobile phase to reversed-phase microcolumn. Our data indicate that combining the phosphopeptide enrichment with the microgradient separation is a promising technique for in-depth phosphoproteomic analysis due to moderate input material requirements and more than 3-fold enhanced protein identification.	phosphopeptides; fractionation; acetonitrile; gradient; enrichment; mass spectrometry; titanium dioxide

Vyhledávání

Přihlášení pro studenty

Přihlášení pro zaměstnance

Publikace detail

Katedry

Ústavy a pracoviště

Jak nás najdete?

Služby

Často hledáte