Publikace detail

Enzymové mikroreaktory - nástroj bioafintní chromatografie v proteomice

Rok: 2003

Druh publikace: ostatní - dizertace

Název nakladatele: Univerzita Pardubice, Fakulta chemicko-technologická

Místo vydání: Pardubice

Strana od-do: nestránkováno

Tituly:

Jazyk	Název	Abstrakt	Klíčová slova
cze	Enzymové mikroreaktory - nástroj bioafintní chromatografie v proteomice	Účelem této práce bylo vyvinout enzymové a bioafinitní mikrosystémy pro peptidové mapování a přípravu modelových proteinů vysoce heterogenních biomolekul. Lidský imunoglobulin G byl vybrán jako modelový glykoprotein s heterogenitou v podtřídách, v aminokyselinové sekvenci variabilních domén v blízkosti vazebného místa a v heterogenitě post-translačních modifikací. Pro studium komplexní molekuly IgG byly používány enzymové reaktory, připravené imobilizací na magnetické mikro- až nanopartikule. Byly použity nově vyvinuté magnetické mikro- a nanopartikule s minimální nespecifickou sorpcí a nulovou agregací. Byly připraveny enzymové reaktory (IMERs) ke specifickému štěpení (papain z Carica papaya) a vysoce specifické fragmentaci (trypsin z hovězího pankreatu) standardní molekuly IgG. Trypsin imobilizovaný na magnetické celulózové mikropartikule byl ke specifické fragmentaci použit v mikročipovém zařízení. Tento systém umožnil výrazně změnit kinetické parametry, jako např. poměr složek enzym : substrát v reakčním prostředí a zkrácení času potřebného k úplné fragmentaci analytu z několika hodin na minuty. Pro studium a kvantifikaci jednotlivých glykoforem IgG je nutné získat standardy s kvalitativně definovanou glykosylací. Pro jejich přípravu byly vyvinuty enzymové reaktory. Neuraminidáza z Clostridium perfringens orientovaně imobilizována na hydrazidový derivát perlové celulózy byla použita pro desialyzaci, -D-galaktosidáza z Escherichia coli byla imobilizována na neporézní mikrocelulózu pro degalaktosylaci glykosidického řetězce IgG. Kvalita obou reaktorů byla ověřena specifickou sorpcí fragmentů k lektinům Concanavalin A, Bandeireae simplicifolia I a II.	papain, trypsin, neuraminidáza, beta-D-galaktosidáza, IMERs, IgG, Concanavalin A, Bandeireae simplicifolia I, II
eng	Enzyme microreactors, tools of bioaffinity chromatography for proteomics	The main goal of this project was to develop the microproteomic systems for peptide mapping and evaluation of highly heterogenous biomolecules. Immunoglobulin IgG was selected as a model glycoprotein with high heterogeneity in subclasses, in AA sequence of variable domains near the binding sites, in PTM as glycosylation. Enzymes are due to its unique specificity often used for studying of highly complex proteins. Immobilization of the enzymes is often necessary assumption for their use in protein microanalysis and modification. Newly developed nano- and microspheres with controlled non-specific sorption and with controlled tendency to aggregate were used. Carboxyle derivative of microporous bead cellulose (particle size 5 - 10 μm) and of latex particles (particles size 0,875 μm) were used for immobilization procedure by carbodiimide. To form stable hydrazons with enzyme was used hydrazide derivative of macroporous bead cellulose (particle size 80 ? 100 μm). The immobilized enzyme reactors (IMERs) for specific dissection (papain from Carica papaya) and highly specific fragmentation (trypsin from bovine pancreas) of standard IgG molecule were prepared. Trypsin immobilized to a magnetic nano-particules was utilized for digestion of IgG even on a CHIP device. Hydrazide derivatives of macroporous bead celulose were used for oriented immobilization of neuraminidase (sialidase) from Clostridium perfringens ? exoglycosidase specifically spliting -linked N-acetylneuramine acid from glycoside chain. For immobilization of ?D-galactosidase from Escherichia coli porous bead cellulose and carboxyl derivatives of nanoporous microbead cellulose were used. This exoglycosidase specifically cleaves terminal galactose on sacharide chain and was used to prepare so-called agalactosylated IgG. Quality of both reactors modifying the oligosacharide chain of Fc fragment IgG was established by lectin affinity chromatography (Concanavalin A, Bandeire

Search

Přihlášení pro studenty

Přihlášení pro zaměstnance

Publikace detail

Katedry

Ústavy a pracoviště

Jak nás najdete?

Služby

Často hledáte