Univerzita Pardubice Fakulta chemicko- technologická

Univerzita Pardubice

Zaměstnanci
|
Studenti
English

Publikace detail

Izolace a identifikace hydrofobinu SC3

Autoři: Zelená Miroslava | Kupčík Rudolf | Česlová Lenka | Řehulka Pavel | Bílková Zuzana

Rok: 2015

Druh publikace: ostatní - přednáška nebo poster

Strana od-do: nestránkováno

Tituly:

Jazyk	Název	Abstrakt	Klíčová slova
cze	Izolace a identifikace hydrofobinu SC3	Hydrofobiny jsou primární metabolity produkované plísněmi. Tyto malé proteiny mají molekulovou hmotnost mezi 7-15 kDa a v primární sekvenci se vyznačují typickým vzorem osmi cysteinů. Tyto cysteiny jsou propojeny čtyřmi disulfidickými můstky. Na základě rozpustnosti a jejich struktury se rozdělují do dvou skupin (třídy I a II). Charakteristickou vlastností hydrofobinů je povrchová aktivita a schopnost samoshluknutí na různých typech rozhraní. Izolace hydrofobinů je vzhledem k jejich vlastnostem značně obtížná. V této práci byla pro izolaci hydrofobinu SC3 (Schizophyllum commune) z třídy I vyvinuta nová metoda, která využívá vysokou hydrofobicitu těchto proteinů a silnou afinitu k teflonu jako adsorbčnímu činidlu. Pomocí teflonových mikročástic se podařilo selektivně izolovat hydrofobin SC3 z modelových směsí čtyř a deseti proteinů. Tato technika je velmi efektivní, časově nenáročná a představuje velký potenciál pro izolaci hydrofobinů třídy I z reálných vzorků. Účinnost izolace hydrofobinů z modelové směsi proteinů byla ověřena pomocí tricinové SDS-PAGE. Identifikace hydrofobinu SC3 byla provedena pomocí hmotnostní spektrometrie s MALDI ionizací, kdy byly využity dva hmotnostní spektrometry s různými analyzátory – analyzátor doby letu (TOF) a orbitální past (Orbitrap). Pro analýzu na MALDI-TOF/TOF hmotnostním spektrometru byl použit intaktní hydrofobin SC3, ale před analýzou na peptidové úrovni pomocí MALDI-Orbitrap (m/z 50 – 4000) bylo nutné nejdříve protein enzymaticky naštěpit. Na základě obsahu aminokyselin v primární struktuře analyzovaného proteinu bylo enzymatické štěpení provedeno pomocí chymotrypsinu a thermolysinu. Úspěšnost štěpení je podmíněna efektivní redukcí a alkylací disulfidických můstků, jelikož hydrofobiny jsou jimi vysoce stabilizované. V dalším kroku bylo provedeno vlastní enzymatické štěpení a jeho úspěšnost byla ověřena opět pomocí tricinové SDS-PAGE. Vzniklé peptidy byly analyzovány pomocí MALDI-Orbitrap hmotnostní spektrometrie