Publikace detail

Difficulties associated with the structural analysis of proteins susceptible to form aggregates: The case of Tau protein as a biomarker of Alzheimer’s disease

Rok: 2016

Druh publikace: článek v odborném periodiku

Název zdroje: Journal of Separation Science

Strana od-do: 799-807

Tituly:

Jazyk	Název	Abstrakt	Klíčová slova
cze	Obtíže spojené s strukturní analýzu proteinů náchylných k tvorbě agregátů: Případ proteinu Tau jako biomarkeru Alzheimerovy choroby	Hmotnostní spektrometrie spojená s bioafinitními separačními technikami je považována za silný nástroj pro studium interakcí proteinů. Tato práce je zaměřena na epitopovou analýzu tau proteinu, který obsahuje dva VQIXXK agregační motivy, které jsou považovány za klíčové prvky při tvorbě párových šroubovicových vláken, které jsou hlavní patologickou charakteristikou Alzheimerovy choroby. K identifikaci hlavních imunogenních struktur byla aplikována technika epitopové extrakce využívající fragmentaci proteinu a magnetické mikročástice funkcionalizované konkrétními protilátkami. Nicméně, přírozená přilnavost některých nově vytvořených peptidů znehodnocuje experimentální výsledky. Kromě předpokládaného peptidového fragmentu, který je specifický pro aplikované monoklonální protilátky anti-tau, technika epitopové extrakce opakovaně odhalila mimo jiné i tryptický fragment 299-HVPGGGSVQIVYKPVDLSK-317, který obsahuje fibrily tvořící motiv 306-VQIVYK-311. Proagregační a hydrofobní vlastnosti tryptického fragmentu, které by mohly přispět k adsorpčním jevu, byly zkoumány Thioflavin S testem a reverzně-fázovou chromatografií. Bylo testováno několik konvenčních přístupů ke snížení nespecifické sorpce fragmentu na magnetickém povrchu částic, nicméně bez efektu. Aby se předešlo metodickým komplikacím, byl zaveden inovativní přístup založený na pozměněném proteolytickém štěpení. Simultánní fragmentace tau proteinu dvěma imobilizovanými proteázami lišícími se ve specificitě štěpení (TPCK-trypsin a alfa-chymotrypsin), což vedlo k narušení motivem odpovědného za nežádoucí přilnavosti a umožnilo nám to získat nezkreslené strukturní údaje.	Epitopová extrakce; Hmotnostní pektrometrie; Nespecifická sorpce; Tau protein; Thioflavin S test
eng	Difficulties associated with the structural analysis of proteins susceptible to form aggregates: The case of Tau protein as a biomarker of Alzheimer’s disease	Mass spectrometry coupled with bioaffinity separation techniques is considered a powerful tool for studying protein interactions. This work is focused on epitope analysis of tau protein, which contains two VQIXXK aggregation motifs regarded as crucial elements in the formation of paired helical filaments, the main pathological characteristics of Alzheimer’s disease. To identify major immunogenic structures, the epitope extraction technique utilizing protein fragmentation and magnetic microparticles functionalized with specific antibodies was applied. However, the natural adhesiveness of some newly generated peptide fragments devalued the experimental results. Beside presumed peptide fragment specific to applied monoclonal anti-tau antibodies, the epitope extraction repeatedly revealed inter alia tryptic fragment 299-HVPGGGSVQIVYKPVDLSK-317 containing the fibril-forming motif 306-VQIVYK-311. The tryptic fragment pro-aggregation and hydrophobic properties that might contribute to adsorption phenomenon were examined by Thioflavin S and reversed-phase chromatography. Several conventional approaches to reduce the non-specific fragment sorption onto the magnetic particle surface were performed, however with no effect. To avoid methodological complications, we introduced an innovative approach based on altered proteolytic digestion. Simultaneous fragmentation of tau protein by two immobilized proteases differing in the cleavage specificity (TPCK-trypsin and alpha-chymotrypsin) led to the disruption of motif responsible for undesirable adhesiveness and enabled us to obtain undistorted structural data.	Epitope extraction; Mass spectrometry; Nonspecific sorption; Tau protein; Thioflavin S assay

Search

Přihlášení pro studenty

Přihlášení pro zaměstnance

Publikace detail

Katedry

Ústavy a pracoviště

Jak nás najdete?

Služby

Často hledáte