Publikace detail

Optimalizace značení oligo RNA a jejich využití k porovnání metod izolace miRNA z lymfatických nádorových buněk

Autoři: Smělá Denisa | Kročová Eliška | Kupčík Rudolf | Bílková Zuzana

Rok: 2018

Druh publikace: ostatní - přednáška nebo poster

Strana od-do: nestránkováno

Tituly:

Jazyk	Název	Abstrakt	Klíčová slova
cze	Optimalizace značení oligo RNA a jejich využití k porovnání metod izolace miRNA z lymfatických nádorových buněk	Molekuly miRNA patří mezi krátké RNA, které regulují genovou expresi na post-transkripční úrovni. Změna exprese miRNA může vést k patologii a je spojována s různými nádorovými onemocněními. Z tohoto důvodu jsou často analyzovány RT-qPCR či metodami sekvenování nové generace. Pro izolaci RNA z biologického materiálu se používají komerčně dostupné soupravy. Není proto běžné, že by výstupní kvalita vzorku byla kontrolována jinak, než stanovením celkové koncentrace RNA. Chceme-li se ale zaměřit na analýzu krátkých RNA molekul, měli bychom sledovat, s jakou účinností jsou izolovány. Rozhodli jsme se proto porovnat relativní výtěžnosti miRNA tří komerčně dostupných metod, lišících se principem izolace RNA. TRIzolTM Reagent je založen na fenol-chloroformové extrakci, díky které získáváme celkovou RNA. Fenol-chloroformovou extrakci využívá v kombinaci s extrakcí na pevnou fázi také mirVanaTM miRNA Isolation Kit. MirVanaTM nabízí možnost izolace jak celkové RNA, tak i RNA kratších než 200 nukleotidů. Další testovanou metodou byl MagMAXTM mirVanaTM Total RNA Isolation Kit, který umožňuje zisk celkové RNA. Využívá k tomu extrakci na pevnou fázi, kterou jsou v tomto případě magnetické částice. Výchozím materiálem byly T‑ a B-lymfatické nádorové linie JURKAT a RAJI. Srovnáním jsme zjistili, že pro izolaci miRNA je nejvýhodnější TRIzolTM Reagent, který poskytoval nejvyšší relativní výtěžnost. Největší ztráty v průběhu experimentu byly pozorovány u MagMAXTM mirVanaTM Total RNA Isolation Kit. Zvolené metody byly porovnány z hlediska relativní výtěžnosti oligo RNA, a proto byla k detekci vybrána elektroforetická separace se zaměřením na účinné dělení oligo RNA. Zde bylo nutné najít dostatečně citlivý systém detekce krátkých jednovláknových molekul. K otestování a optimalizaci byly vybrány tři možnosti barvení RNA – SYBRTM Safe, SYBRTM Green II a Toluidine Blue O. Jako nejlepší se pro vizualizaci oligo RNA jeví SYBRTM Green II, kterým byla detekována i oligo RNA dlouhá 10 nukleotidů.

Vyhledávání

Přihlášení pro studenty

Přihlášení pro zaměstnance

Publikace detail

Katedry

Ústavy a pracoviště

Jak nás najdete?

Služby

Často hledáte